🎯 วัตถุประสงค์การเรียนรู้
- อธิบายและเลือกใช้ตัวทำละลายในการสกัดได้อย่างถูกต้องและเหมาะสม
- อธิบายการสกัดด้วยวิธีต่างๆ พร้อมข้อดี-ข้อเสียของแต่ละวิธี
- อธิบายฤทธิ์ทางชีวภาพของสมุนไพรและวิธีการทดสอบ
📋 ส่วนที่ 1: การสกัดสมุนไพร (Extraction of Herbal Medicines)
ความหมายและหลักการ
การสกัด (Extraction) คือ กระบวนการแยกสารสำคัญ (Active Constituents) ออกจากสมุนไพรโดยใช้ ตัวทำละลาย (Solvent)
สารที่ได้จากการสกัดประกอบด้วย:
- สารสำคัญ (Active Constituents) - มีฤทธิ์ทางเภสัชวิทยา สร้างผลทางการรักษา
- สารเฉื่อย (Inert Substances) - ไม่มีฤทธิ์ทางเภสัชวิทยา แต่อาจช่วยเสริมการทำงาน
💡 สารสกัดหยาบ (Crude Extract): สารที่สกัดออกมาจากสมุนไพรครั้งแรก ซึ่งเป็นของผสมขององค์ประกอบทางเคมีหลายชนิด ยังต้องผ่านกระบวนการแยกและทำให้บริสุทธิ์ต่อไป
วัตถุประสงค์ของการสกัด
1. สกัดแยกสารสำคัญ
แยกเอาสารสำคัญออกจากส่วนอื่นๆ ของพืช เช่น เส้นใยพืช แป้ง น้ำตาล
2. เพิ่มความเข้มข้น
ทำให้สารสำคัญมีความเข้มข้นสูงขึ้น เพื่อประสิทธิภาพในการใช้งาน
3. ลดขนาดการใช้
ลดปริมาณที่ต้องใช้ให้อยู่ในระดับที่เหมาะสมและสะดวกต่อการบริโภค
ตัวอย่าง: พริกไทยกินไม่เกิน 3-5 เม็ด แต่ถ้าเป็นสารสกัดอาจใช้เพียง 1-2 แคปซูล
หลักการเลือกตัวทำละลาย
⚡ หลักสำคัญ: "Like Dissolves Like" (สารละลายคล้ายๆ กัน)
- สารมีขั้ว (Polar) → ใช้ตัวทำละลายมีขั้ว เช่น น้ำ, แอลกอฮอล์, เมทานอล
- สารไม่มีขั้ว (Non-polar) → ใช้ตัวทำละลายไม่มีขั้ว เช่น เฮกเซน, คลอโรฟอร์ม, อีเทอร์
- สารมีขั้วปานกลาง → ใช้ตัวทำละลายผสม เช่น แอลกอฮอล์ 70%
คุณสมบัติของตัวทำละลายที่ดี
- ✅ มีความสามารถในการละลายสารสำคัญที่ต้องการออกมาให้มากที่สุด
- ✅ มีความจำเพาะ (Selective) - ละลายเฉพาะสารที่ต้องการ ไม่ละลายสารเฉื่อยออกมามาก
- ✅ มีความคงตัว - ไม่เกิดปฏิกิริยากับสารสกัด
- ✅ หาง่าย ราคาถูก - เหมาะกับการผลิตในเชิงพาณิชย์
- ✅ ไม่เป็นพิษต่อร่างกาย - หรือต้องระเหยออกให้หมดก่อนใช้
- ✅ ระเหยได้เหมาะสม - ไม่ระเหยง่ายหรือยากเกินไป
ตัวทำละลายที่ใช้ในการสกัดสมุนไพร
| ตัวทำละลาย |
ขั้ว |
ข้อดี ✅ |
ข้อเสีย ⚠️ |
น้ำ
(Water) |
มีขั้วสูง |
• หาง่าย ราคาถูกที่สุด
• ปลอดภัย ไม่เป็นพิษ
• เหมาะกับสารละลายน้ำ
|
• ละลายสารเฉื่อย (น้ำตาล แป้ง โปรตีน)
• บูดเน่าง่าย
• ต้องใช้ความร้อนสูงในการระเหย (100°C)
|
แอลกอฮอล์
(Ethanol) |
มีขั้วปานกลาง |
• มีความจำเพาะสูง
• ละลายสารได้หลายชนิด
• ยับยั้งจุลินทรีย์
• ปลอดภัย ระเหยง่าย
• ใช้ได้ทั้งบริสุทธิ์และผสมน้ำ
|
• ราคาแพงกว่าน้ำ
• ต้องมีใบอนุญาต (ในบางประเทศ)
|
เมทานอล
(Methanol) |
มีขั้วสูง |
• ละลายสารมีขั้วได้ดี
• ราคาถูกกว่าเอทานอล
• ระเหยง่าย (65°C)
|
• เป็นพิษสูง
• ต้องระเหยออกให้หมด
• ห้ามใช้ในผลิตภัณฑ์บริโภคโดยตรง
|
คลอโรฟอร์ม
(Chloroform) |
มีขั้วน้อย |
• ละลายสารไม่มีขั้วได้ดี
• ละลายไขมัน น้ำมัน
• ระเหยง่าย
|
• เป็นพิษ
• ก่อมะเร็ง
• ใช้เฉพาะงานวิจัย
|
อีเทอร์
(Ether) |
มีขั้วน้อย |
• ละลายสารไม่มีขั้วได้ดี
• ระเหยเร็วมาก
|
• ไวไฟมาก
• ระเหยง่ายเกินไป
• เป็นพิษ
|
เฮกเซน
(Hexane) |
ไม่มีขั้ว |
• ละลายสารไม่มีขั้วได้ดีมาก
• ใช้สกัดน้ำมัน
• ราคาถูก
|
• ไม่ละลายสารมีขั้ว
• ไวไฟ
• ต้องระเหยออกให้หมด
|
กลีเซอรีน
(Glycerin) |
มีขั้วสูง |
• ปลอดภัย
• ใช้ในเครื่องสำอางได้
• เป็นสารชุ่มชื้น
|
• ไม่ระเหย
• ข้นหนืด ใช้งานลำบาก
• ละลายสารได้น้อยกว่าแอลกอฮอล์
|
💡 เคล็ดลับการเลือกตัวทำละลาย
- สกัดสารละลายน้ำ (เช่น แทนนิน, กลูโคไซด์) → ใช้น้ำ หรือแอลกอฮอล์ 40-70%
- สกัดอัลคาลอยด์ → ใช้แอลกอฮอล์ 70-95% หรือเมทานอล
- สกัดน้ำมันหอมระเหย → ใช้การกลั่น ไม่ใช้ตัวทำละลาย
- สกัดสารไม่มีขั้ว (เช่น คาโรทีนอยด์) → ใช้เฮกเซน หรือคลอโรฟอร์ม
- สกัดเพื่อใช้ในเครื่องสำอาง → ใช้กลีเซอรีน หรือโพรพีลีนไกลคอล
🔬 วิธีการสกัดสมุนไพร
1. การคั้นน้ำจากพืชสด (Juicing/Expression)
หลักการ
แยกส่วนของเหลว (น้ำ) ออกจากกาก โดยใช้แรงกด บีบ หรือปั่น
ขั้นตอน
- เตรียมพืชสด ล้างทำความสะอาด
- หั่นหรือย่อยให้เป็นชิ้นเล็ก
- ใช้เครื่องปั่นหรือเครื่องคั้นน้ำผลไม้
- กรองแยกกาก เก็บน้ำ
✅ ข้อดี
- ง่าย รวดเร็ว
- ประหยัดเวลาและต้นทุน
- ไม่ใช้สารเคมี
- ได้สารสดใหม่
⚠️ ข้อเสีย
- มีสารเฉื่อย (น้ำตาล แป้ง โปรตีน) ติดมามาก
- บูดเสียง่าย อายุสั้น
- ต้องเก็บในตู้เย็น
- ใช้เฉพาะพืชที่มีน้ำมาก
พืชที่เหมาะสม: กระเทียม, ขิง, แตงกวา, มะเขือเทศ, น้ำดอกอัญชัน
ตัวอย่างผลิตภัณฑ์: น้ำกระเทียม, น้ำขิง, น้ำผักผลไม้
2. การต้ม (Decoction)
หลักการ
ใช้ความร้อนจากการต้มด้วยน้ำ ทำให้สารสำคัญละลายออกมา เหมาะกับสารที่ทนความร้อนและละลายน้ำ
ขั้นตอนละเอียด
- เตรียมวัตถุดิบ: ใช้สมุนไพรสดหรือแห้ง ย่อยเป็นชิ้นเล็กๆ
- แช่น้ำ: เติมน้ำตามอัตราส่วนที่กำหนด ตั้งทิ้งไว้จนสมุนไพรเปียก (สังเกตจากชิ้นสมุนไพรจมน้ำ)
- ต้ม: ยกขึ้นตั้งไฟ รอจนเดือด จับเวลา ½-1 ชั่วโมง
- ทิ้งให้เย็น: ยกลง ทิ้งให้เย็นจึงกรอง
- เก็บสารสกัด: เก็บน้ำที่กรองแล้ว
- ต้มซ้ำ (ถ้าต้องการ): กากนำไปต้มซ้ำ แต่ใช้น้ำน้อยกว่าเดิม รวมสารสกัดเข้าด้วยกัน
✅ ข้อดี
- วิธีดั้งเดิม ง่าย ไม่ซับซ้อน
- ใช้อุปกรณ์พื้นฐาน
- สกัดได้เร็ว
- เหมาะกับการผลิตในครัวเรือน
⚠️ ข้อเสีย
- ไม่เหมาะกับสารที่ไม่ทนความร้อน
- สารบางชนิดอาจสลายตัว (เช่น วิตามินซี)
- ใช้เวลานาน
- สูญเสียพลังงาน
พืชที่เหมาะสม: ราก เหง้า เปลือกไม้ ที่มีเนื้อแข็ง
ตัวอย่าง: ฟ้าทะลายโจร, ขมิ้นชัน, เปลือกมังคุด, รากบัวบก
3. การหมัก/มาเซเรชัน (Maceration)
หลักการ
หมักสมุนไพรกับตัวทำละลายในภาชนะปิดสนิท ไม่ใช้ความร้อน ให้ตัวทำละลายแทรกเข้าไปละลายสารสำคัญออกมาอย่างช้าๆ
ขั้นตอนละเอียด
- เตรียมสมุนไพร: ชั่งสมุนไพรแห้ง 100 กรัม ใส่ในบีกเกอร์
- เติมตัวทำละลาย (ครั้งที่ 1): เติม 30 มล. คนให้ทั่ว ทิ้งไว้ ½-1 ชั่วโมง จนสมุนไพรเปียก
- เติมตัวทำละลายเพิ่ม: เติมจนท่วมสมุนไพรเล็กน้อย ทิ้งไว้ 4 ชั่วโมง
- ถ่ายใส่ภาชนะ: ถ่ายสมุนไพรทั้งหมดลงในเครื่องสกัด/ขวดปิดสนิท
- เติมตัวทำละลายจนเต็ม: เติมจนท่วม ทิ้งไว้ 12 ชั่วโมง
- เปิดก๊อก/เขย่า: ให้สารละลายไหลออกช้าๆ 4-6 หยดต่อนาที หรือเขย่าวันละ 2-3 ครั้ง
- หมักต่อ: ทิ้งไว้ 7 วัน (หรือจนสารสกัดหมด)
- กรอง: กรองแยกกาก เก็บสารสกัด
✅ ข้อดี
- ไม่ใช้ความร้อน - เหมาะกับสารที่ไวต่อความร้อน
- ประหยัดตัวทำละลาย
- ใช้อุปกรณ์ง่าย
- ทำได้ในปริมาณมาก
⚠️ ข้อเสีย
- ใช้เวลานาน (7 วัน)
- ต้องเขย่าหรือคนเป็นครั้งคราว
- ต้องมีภาชนะปิดสนิท
- เสี่ยงการปนเปื้อนถ้าไม่สะอาด
ตัวทำละลายที่ใช้: แอลกอฮอล์ 40-95%, เมทานอล, กลีเซอรีน
เหมาะกับ: ใบ ดอก สารที่ไม่ทนความร้อน เช่น น้ำมันหอมระเหย, วิตามิน
4. การสกัดแบบต่อเนื่อง (Continuous Extraction / Soxhlet)
หลักการ
ใช้ความร้อนและการสกัดแบบต่อเนื่องในระบบปิด ตัวทำละลายระเหยขึ้น กลั่นตัวลง ไหลผ่านสมุนไพรซ้ำแล้วซ้ำเล่า
องค์ประกอบของเครื่อง Soxhlet
- Round-bottom flask: ภาชนะใส่ตัวทำละลาย อยู่ด้านล่าง ต่อกับเครื่องให้ความร้อน
- Soxhlet chamber: ส่วนกลาง ใส่ thimble (ถุงกระดาษใส่สมุนไพร)
- Condenser: ส่วนบนสุด ทำหน้าที่กลั่นตัว มีน้ำเย็นไหลผ่าน
- Siphon tube: ท่อดูดสารสกัดกลับลงไปยัง flask
ขั้นตอน
- ใส่สมุนไพรแห้งในถุงกระดาษ (thimble)
- วางใน Soxhlet chamber
- เติมตัวทำละลายใน round-bottom flask
- ต่อเครื่องให้ความร้อน (heating mantle หรือ water bath)
- ตัวทำละลายระเหย → กลั่นตัวที่ condenser → หยดลงในถุงสมุนไพร → ละลายสารสำคัญ → ไหลกลับลง flask
- ทำซ้ำต่อเนื่องหลายรอบ จนสารสกัดหมด (สังเกตจากสารละลายที่ไหลกลับใส)
- ปิดเครื่อง เก็บสารสกัดจาก flask
✅ ข้อดี
- ใช้ตัวทำละลายน้อย (ระบบปิด หมุนเวียน)
- สกัดได้หมด ประสิทธิภาพสูง
- ไม่ต้องเขย่าหรือคน
- ทำงานอัตโนมัติ
⚠️ ข้อเสีย
- ใช้ความร้อน - ไม่เหมาะกับสารไม่ทนความร้อน
- ตัวทำละลายต้องเป็นของบริสุทธิ์ (ไม่ใช่ของผสม)
- อุปกรณ์แพง ซับซ้อน
- ใช้เวลานาน (6-24 ชม.)
ตัวทำละลายที่ใช้: เฮกเซน, คลอโรฟอร์ม, อีเทอร์, แอลกอฮอล์
เหมาะกับ: การสกัดไขมัน น้ำมัน สารไม่มีขั้ว งานวิจัย
5. การสกัดแบบชง (Percolation)
หลักการ
ให้ตัวทำละลายไหลผ่านสมุนไพรอย่างช้าๆ และต่อเนื่อง จากบนลงล่าง แล้วเก็บสารสกัดที่ไหลออกมา
ขั้นตอนละเอียด
- เตรียมสมุนไพร: ชั่ง 100 กรัม ใส่บีกเกอร์ เติมตัวทำละลาย 30 มล. คนให้ทั่ว ทิ้งไว้ ½-1 ชั่วโมง
- เติมตัวทำละลายเพิ่ม: จนท่วมเล็กน้อย ทิ้งไว้ 4 ชั่วโมง
- เตรียม Percolator: ใส่สำลีเปียกตัวทำละลายที่ก้นเครื่อง
- ถ่ายสมุนไพร: ถ่ายสมุนไพรทั้งหมดใส่ Percolator
- เติมตัวทำละลาย: เติมจนท่วม ทิ้งไว้ 12 ชั่วโมง
- เปิดก๊อก: ให้สารละลายไหลออกช้าๆ 4-6 หยดต่อนาที
- เติมตัวทำละลายเพิ่ม: ตามที่สารละลายไหลออก เพื่อให้มีระดับสารละลายคงที่
- เก็บสารสกัด: เก็บสารสกัดที่ไหลออกมาจนหมด
✅ ข้อดี
- สารสกัดเข้มข้นสูง
- ใช้เวลาสั้นกว่ามาเซเรชัน
- สกัดได้อย่างต่อเนื่อง
- คุณภาพดี
⚠️ ข้อเสีย
- ต้องมี Percolator เฉพาะ
- ต้องคอยเติมตัวทำละลาย
- สมุนไพรต้องบดละเอียดพอดี (ไม่หยาบหรือละเอียดเกินไป)
💡 เคล็ดลับ: ควบคุมอัตราการไหลให้ช้า เพื่อให้สารสำคัญละลายออกมาได้เต็มที่
6. การสกัดด้วยไมโครเวฟ (Microwave-Assisted Extraction, MAE)
หลักการ
ใช้คลื่นไมโครเวฟให้ความร้อนกับตัวทำละลาย ทำให้ตัวทำละลายร้อนขึ้นและแพร่เข้าไปในเซลล์พืช เซลล์แตก สารสำคัญละลายออกมา
ขั้นตอน
- ใส่สมุนไพรและตัวทำละลายในภาชนะทนความร้อน
- ปิดฝาให้แน่น (ใช้ภาชนะที่ทนแรงดัน)
- ใส่ในเครื่องไมโครเวฟ
- ตั้งเวลาและกำลังตามที่เหมาะสม (โดยปกติ 2-10 นาที)
- ทิ้งให้เย็น กรองแยกกาก
✅ ข้อดี
- เร็วมาก (2-10 นาที)
- ใช้ตัวทำละลายน้อย
- ประหยัดพลังงาน
- ประสิทธิภาพสูง
⚠️ ข้อเสีย
- ใช้ความร้อน - สารบางชนิดอาจเสียหาย
- ต้องมีเครื่องไมโครเวฟเฉพาะ (ห้ามใช้เครื่องบ้าน)
- ต้องระวังแรงดัน
- ราคาอุปกรณ์แพง
เหมาะกับ: โพลีฟีนอล, ฟลาโวนอยด์, สารที่ทนความร้อน
ตัวทำละลาย: น้ำ, แอลกอฮอล์, เมทานอล
7. การสกัดด้วยคลื่นเสียงความถี่สูง (Ultrasound-Assisted Extraction, UAE)
หลักการ
ใช้คลื่นเสียงความถี่สูง (20-100 kHz) สร้างฟองอากาศเล็กๆ ในตัวทำละลาย ฟองแตก สร้างแรงกระแทก ทำลายผนังเซลล์ สารสำคัญหลุดออกมา
ขั้นตอน
- ใส่สมุนไพรและตัวทำละลายในบีกเกอร์
- วางในถาด Ultrasonic bath หรือใส่ Ultrasonic probe ลงไป
- เปิดเครื่อง ตั้งเวลา 15-60 นาที
- กรองแยกกาก
✅ ข้อดี
- ไม่ใช้ความร้อน - เหมาะกับสารไวต่อความร้อน
- ใช้เวลาน้อย (15-60 นาที)
- ใช้ตัวทำละลายน้อย
- ประสิทธิภาพสูง
⚠️ ข้อเสีย
- ต้องมีเครื่อง Ultrasonic
- ราคาอุปกรณ์ค่อนข้างแพง
- อาจมีเสียงดัง
เหมาะกับ: สารที่ไม่ทนความร้อน น้ำมันหอมระเหย วิตามิน
นิยมใช้: ในงานวิจัย ห้องปฏิบัติการ
8. การสกัดน้ำมันหอมระเหย (Essential Oil Extraction)
วิธีที่ 1: การกลั่นด้วยน้ำหรือไอน้ำ (Steam Distillation)
ใช้ไอน้ำผ่านสมุนไพร น้ำมันหอมระเหยระเหยตามไอน้ำ กลั่นตัว แยกชั้นจากน้ำ
- ข้อดี: ได้น้ำมันบริสุทธิ์, ไม่ใช้สารเคมี, ปลอดภัย
- ข้อเสีย: ใช้เวลานาน, ต้องมีอุปกรณ์กลั่น
- ตัวอย่าง: น้ำกุหลาบ, น้ำดอกจำ, น้ำมันตะไคร้
วิธีที่ 2: Enfleurage
ใช้แผ่นกระจกเคลือบไขมัน วางกลีบดอกไม้สด เก็บในตู้เย็น ไขมันดูดซับกลิ่น เปลี่ยนดอกไม้ใหม่จนไขมันอิ่มตัว แล้วใช้แอลกอฮอล์สกัดน้ำมัน
- ข้อดี: ได้กลิ่นธรรมชาติสูง, เหมาะกับดอกไม้ละเอียดอ่อน
- ข้อเสีย: ใช้เวลานานมาก, แรงงานมาก, ราคาแพง
- ตัวอย่าง: น้ำหอมจากมะลิ, ดอกกุหลาบ
วิธีที่ 3: Liquid CO₂ Extraction
ใช้ก๊าซคาร์บอนไดออกไซด์ภายใต้ความดันสูง กลายเป็นของเหลว ละลายน้ำมัน ระเหยก๊าซออก เหลือแต่น้ำมัน
- ข้อดี: ได้น้ำมันบริสุทธิ์สูงสุด, เหมือนธรรมชาติที่สุด, ไม่มีสารตกค้าง
- ข้อเสีย: ลงทุนสูงมาก, ต้องมีเทคโนโลยีขั้นสูง
- ใช้ใน: อุตสาหกรรมระดับโลก
🔥 การทำให้สารสกัดเข้มข้น (Concentration)
วัตถุประสงค์: ระเหยตัวทำละลายออก เพื่อเพิ่มความเข้มข้นของสารสำคัญ และลดปริมาตร ทำให้เก็บและขนส่งง่ายขึ้น
| วิธีการ |
รายละเอียด |
เหมาะกับ |
| 1. ใช้ความร้อนโดยตรง (Direct Heat) |
ต้มระเหยด้วยไฟโดยตรง
ใช้เวลาสั้น แต่ต้องระวังไม่ให้สารสกัดไหม้
|
• ตัวทำละลายน้ำ
• สารทนความร้อน 100-110°C
• การต้มยาไทย
|
| 2. ใช้ความร้อนจากไอน้ำ (Water Bath) |
วางภาชนะสารสกัดในน้ำเดือด
ให้ความร้อนสม่ำเสมอ ไม่ไหม้
|
• ตัวทำละลายน้ำ
• เครื่องไอน้ำระดับครัวเรือน
• ทำง่าย ปลอดภัย
|
| 3. Rotary Evaporator (Rotavap) |
ระเหยภายใต้ความดันต่ำ
จุดเดือดลดลง → ใช้อุณหภูมิต่ำ
หมุนขวดเพื่อเพิ่มพื้นที่ระเหย
|
• ตัวทำละลายอินทรีย์
• สารที่ไม่ทนความร้อน
• งานวิจัย ห้องปฏิบัติการ
|
// ความสัมพันธ์ระหว่างจุดเดือดและความดัน
เมื่อลดความดัน → จุดเดือดลดลง
ตัวอย่าง:
- Ethanol ที่ความดันปกติ (760 mmHg): เดือดที่ 78°C
- Ethanol ที่ความดัน 100 mmHg: เดือดที่ 35-40°C
ดังนั้น Rotavap จึงเหมาะกับสารที่ไวต่อความร้อน
🧬 ส่วนที่ 2: ฤทธิ์ทางชีวภาพของสมุนไพร
🔬 ประเภทของฤทธิ์ทางชีวภาพ
- ฤทธิ์ต้านเชื้อจุลินทรีย์ (Antimicrobial Activity) - ยับยั้งหรือฆ่าแบคทีเรีย เชื้อรา
- ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ (Antioxidant Activity) - ป้องกันการเกิดออกซิเดชัน
- ฤทธิ์ต้านมะเร็ง (Anticancer Activity) - ยับยั้งเซลล์มะเร็ง
- ฤทธิ์ต้านไวรัส (Antiviral Activity) - ยับยั้งหรือฆ่าไวรัส
- ฤทธิ์ต้านการอักเสบ (Anti-inflammatory Activity) - ลดการอักเสบ
1. ฤทธิ์ต้านเชื้อจุลินทรีย์ (Antimicrobial Activity)
📖 คำจำกัดความ
- Antimicrobial: ต้านจุลินทรีย์ทั่วไป (รวมทั้งแบคทีเรีย เชื้อรา ยีสต์)
- Antibacterial: ต้านแบคทีเรียเท่านั้น
- Antifungal: ต้านเชื้อราเท่านั้น
กลไกการทำงาน
- Microbiostatic (ยับยั้งการเจริญ): ทำให้เชื้อหยุดเจริญ แต่ไม่ตาย หากเอาสารออก เชื้ออาจเจริญต่อได้
- Microbicidal (ฆ่าเชื้อ): ฆ่าเชื้อตาย ไม่สามารถเจริญได้อีก
วิธีทดสอบเบื้องต้น (Primary Screening)
| วิธีทดสอบ |
ขั้นตอน |
เหมาะกับ |
| Disc Diffusion |
1. ผสมเชื้อลงในอาหารเลี้ยงเชื้อ
2. วางกระดาษกลมชุบสารทดสอบ
3. บ่มที่ 37°C นาน 18-24 ชม.
4. วัดเส้นผ่านศูนย์กลางบริเวณใส (zone of inhibition)
|
• ตัวอย่างที่ละลายในตัวทำละลายที่ระเหยได้
• ตัวทำละลายไม่มีผลต่อเชื้อ
|
| Well Diffusion |
1. ผสมเชื้อลงในอาหารเลี้ยงเชื้อ
2. เจาะหลุม (well) ขนาด 6 มม.
3. ใส่สารทดสอบลงในหลุม
4. บ่มและวัดผล
|
• ตัวอย่างของเหลว
• สารสกัดที่ไม่ระเหย
• น้ำมันหอมระเหย
|
| Agar Diffusion |
1. ผสมสารสกัดลงในอาหารเลี้ยงเชื้อ
2. เติมเชื้อ
3. บ่มและดูการเจริญ
|
• ตัวอย่างชิ้นวัสดุ
• แผ่นฟิล์ม แผ่นโฟม แผ่นยาง
|
ค่าที่ใช้รายงานผล
📊 MIC (Minimum Inhibitory Concentration)
ความหมาย: ความเข้มข้นต่ำสุดของสารที่สามารถยับยั้งการเจริญของเชื้อได้
วิธีทดสอบ (Microdilution Method):
- เตรียมสารทดสอบหลายความเข้มข้น (เจือจาง 2 เท่า) ใน 96-well plate
- เติมเชื้อปริมาณเท่ากันทุกหลุม
- บ่ม 18-24 ชม. ที่ 37°C
- ดูหลุมที่ไม่มีการเจริญ (ใส ไม่ขุ่น)
- หลุมแรกที่ไม่มีการเจริญ = MIC
ตัวอย่างการอ่านผล:
หลุมที่ 1: 512 μg/mL → มีการเจริญ (ขุ่น)
หลุมที่ 2: 256 μg/mL → มีการเจริญ (ขุ่น)
หลุมที่ 3: 128 μg/mL → ไม่มีการเจริญ (ใส) ← MIC
หลุมที่ 4: 64 μg/mL → ไม่มีการเจริญ (ใส)
ดังนั้น MIC = 128 μg/mL
🔬 MBC (Minimum Bactericidal Concentration)
ความหมาย: ความเข้มข้นต่ำสุดของสารที่สามารถฆ่าเชื้อได้
วิธีทดสอบ:
- จากการทดสอบ MIC เอาสารจากหลุมที่ไม่มีการเจริญ
- นำไปปลูกบนอาหารเลี้ยงเชื้อแข็ง (agar plate)
- บ่ม 18-24 ชม.
- ดูว่ามีเชื้อเจริญหรือไม่
- ความเข้มข้นต่ำสุดที่ไม่มีเชื้อเจริญ = MBC
ตัวอย่าง:
หลุม MIC = 128 μg/mL → เอาไปปลูก → มีเชื้อเจริญ (เชื้อยังไม่ตาย)
หลุม 64 μg/mL → เอาไปปลูก → ไม่มีเชื้อเจริญ (เชื้อตายหมด)
สรุป: MBC = 64 μg/mL
💡 การแปลผล MIC และ MBC:
- MIC/MBC น้อย = ฤทธิ์ยับยั้งเชื้อดี (ใช้สารน้อยก็ได้ผล)
- MIC/MBC มาก = ฤทธิ์ยับยั้งเชื้ออ่อน (ต้องใช้สารมาก)
- MBC/MIC ≤ 4 = สารมีฤทธิ์ฆ่าเชื้อ (Bactericidal)
- MBC/MIC > 4 = สารมีฤทธิ์ยับยั้งเชื้อ (Bacteriostatic)
2. ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ (Antioxidant Activity)
🧪 อนุมูลอิสระ (Free Radical) คืออะไร?
อนุมูลอิสระ คือ อะตอมหรือกลุ่มอะตอมที่มีอิเล็กตรอนที่ไม่มีคู่ (unpaired electron) ทำให้:
- ⚡ ไม่เสถียร (Unstable) - พยายามหาอิเล็กตรอนจากที่อื่น
- ⚡ ว่องไวมาก (Reactive) - ทำปฏิกิริยากับสารอื่นได้ง่าย
- ⚡ ก่อความเสียหาย - ทำลายเซลล์ DNA โปรตีน ไขมัน
แหล่งที่มาของอนุมูลอิสระ
- ☀️ แสงแดด UV
- 🏭 มลพิษทางอากาศ (ควัน ฝุ่น)
- 🚬 บุหรี่
- 😰 ความเครียด
- 🍔 อาหารไม่ดี (ทอด มัน หวานจัด)
- ⚗️ กระบวนการเมแทบอลิซึมในร่างกาย
ผลกระทบของอนุมูลอิสระ
⚠️ ต่อร่างกาย
- ทำลายเซลล์ → โรคต่างๆ
- ผิวแก่เร็ว ริ้วรอย
- มะเร็ง
- โรคหัวใจ
- โรคเบาหวาน
⚠️ ต่ออาหาร
- ออกซิเดชันของไขมัน → หืน
- เปลี่ยนสี กลิ่น รส
- สูญเสียคุณค่าทางโภชนาการ
- อายุสั้น เก็บไม่ได้นาน
💊 สารต้านอนุมูลอิสระ (Antioxidants)
สารต้านอนุมูลอิสระ คือ สารที่สามารถให้อิเล็กตรอนกับอนุมูลอิสระ ทำให้อนุมูลมีเสถียรภาพ หยุดปฏิกิริยาลูกโซ่
กลไกการทำงาน:
Free Radical• (ไม่เสถียร) + Antioxidant (AH)
↓
Free Radical-H (เสถียร) + Antioxidant• (เสถียรเล็กน้อย)
→ Antioxidant• มีเสถียรภาพดีกว่า Free Radical• มาก
→ หยุดปฏิกิริยาลูกโซ่
สารต้านอนุมูลอิสระในธรรมชาติ
| กลุ่มสาร |
ตัวอย่าง |
พบในพืช |
Polyphenols
(โพลีฟีนอล) |
Catechin, Tannin, Ellagic acid |
ชาเขียว, ผลไม้เปลือกแดง, ถั่ว |
Flavonoids
(ฟลาโวนอยด์) |
Quercetin, Anthocyanin, Rutin |
ผลไม้สีสด, บัวบก, ดอกอัญชัน |
Vitamins
(วิตามิน) |
Vitamin C, E, Beta-carotene |
ผัก ผลไม้ ถั่ว เมล็ดพืช |
Phenolic acids
(กรดฟีนอลิก) |
Caffeic acid, Ferulic acid |
กาแฟ, ข้าวกล้อง, ข้าวโพด |
การทดสอบ: DPPH Radical Scavenging Assay
🧪 หลักการทดสอบ DPPH
DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) เป็นอนุมูลอิสระสังเคราะห์ที่มีเสถียรภาพ มีสีม่วง
ปฏิกิริยาเคมี:
DPPH• (สีม่วง) + Antioxidant (AH)
↓
DPPH-H (สีเหลืองอ่อน) + Antioxidant•
→ สีเปลี่ยนจากม่วงเป็นเหลือง
→ วัดการดูดกลืนแสงที่ 517 nm
→ ยิ่งสีจางมาก = ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระสูง
ขั้นตอนการทดสอบ:
- เตรียมสารละลาย DPPH ความเข้มข้น 0.1 mM ในเมทานอล
- เตรียมสารทดสอบหลายความเข้มข้น
- ผสม DPPH 3 mL + สารทดสอบ 1 mL
- บ่มในที่มืด 30 นาที ที่อุณหภูมิห้อง
- วัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 517 nm
- คำนวณ % Inhibition
สูตรคำนวณ % Inhibition:
% Inhibition = [(Abs control - Abs sample) / Abs control] × 100
เมื่อ:
- Abs control = ค่าการดูดกลืนแสงของ DPPH เฉยๆ (ไม่ใส่สารทดสอบ)
- Abs sample = ค่าการดูดกลืนแสงของ DPPH + สารทดสอบ
การรายงานผล:
- % Inhibition = เปอร์เซ็นต์การยับยั้งอนุมูล (ยิ่งสูงยิ่งดี)
- IC₅₀ = ความเข้มข้นของสารที่ยับยั้งอนุมูลได้ 50% (ยิ่งต่ำยิ่งดี)
ตัวอย่างการแปลผล:
• IC₅₀ = 10 μg/mL → ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระดีมาก
• IC₅₀ = 50 μg/mL → ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระดี
• IC₅₀ = 100 μg/mL → ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระปานกลาง
• IC₅₀ > 200 μg/mL → ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระอ่อน
✅ ข้อดีของ DPPH Assay
- ง่าย รวดเร็ว
- ใช้อุปกรณ์พื้นฐาน (Spectrophotometer)
- ไม่ซับซ้อน
- เป็นวิธีเบื้องต้นที่นิยม
- ทำซ้ำได้
⚠️ ข้อจำกัดของ DPPH Assay
- DPPH• เป็นอนุมูลสังเคราะห์ ไม่เหมือนอนุมูลในร่างกายจริง
- ใช้เมทานอลเป็นตัวทำละลาย (สารบางชนิดละลายไม่ได้)
- ไม่สามารถแยกแยะกลไกการทำงานได้
- สารบางชนิดอาจมีสีรบกวนการวัด
💡 วิธีทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระวิธีอื่นๆ
- ABTS Assay - ใช้ ABTS•+ (สีเขียว) แทน DPPH
- FRAP Assay - วัดความสามารถในการรีดิวซ์เหล็ก
- ORAC Assay - วัดความสามารถในการดักจับอนุมูลเมื่อเวลาผ่านไป
- SOD Activity - วัดกิจกรรมเอนไซม์ Superoxide Dismutase
📚 สรุปภาพรวมและการประยุกต์ใช้
🎯 จุดสำคัญที่ต้องจำ
ด้านการสกัด:
- ✅ เลือกตัวทำละลายให้เหมาะสมกับสารที่ต้องการ - ใช้หลัก "Like dissolves like"
- ✅ แต่ละวิธีสกัดมีข้อดี-ข้อเสีย - เลือกตามวัตถุประสงค์และงบประมาณ
- ✅ วิธีที่ใช้ความร้อน - เร็ว แต่ไม่เหมาะกับสารไวต่อความร้อน
- ✅ วิธีที่ไม่ใช้ความร้อน